作为最难治疗的乳腺癌亚型，三阴乳腺癌（TNBC）至今仍缺乏有效的治疗干预手段。TNBC是一类富含铁以及脂质的肿瘤，所以“诱导铁死亡”成为值得探索的治疗策略。但鉴于铁死亡是一个逐步的过程，且受到多种代谢途径的调节，TNBC中铁死亡的清晰图景仍未被揭示。最难治疗的乳腺癌亚型「TNBC」与国自然热门研究对象「铁死亡」如何构建联系？如何着手研究？梅斯小编就这篇发表于《Cell Metabolism》（31.373分）的“Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy”[1]文章入手，来为大家介绍一下。作者采用多组学TNBC数据集（n=465）来评估铁死亡特征，并探索精确靶向TNBC铁死亡的潜在机会。结果发现，TNBC亚型显示出明显的铁死亡相关特征——TNBC亚型LAR肿瘤的特征在于几种铁死亡相关途径的上调和OxPE的富集，这意味着铁死亡的潜在脆弱性。同时，LAR肿瘤如何灭活铁死亡程序以逃避细胞死亡尚不清楚。这也促使研究者关注LAR肿瘤中铁死亡的调节机制，以探索治疗方案。研究思路：根据之前的研究，研究者猜想TNBC与铁死亡之间存在联系，但是具体是何种联系还有待挖掘。于是，作者基于铁死亡与细胞代谢的联系采用多组学分析，研究TNBC四种亚型与铁死亡的关系，最终定位到TNBC亚型之一LAR肿瘤。2、谷胱甘肽代谢对于抑制LAR肿瘤中的铁死亡至关重要作者采用代谢组学和转录组学数据来探索抑制LAR肿瘤铁死亡的最主要途径，发现LAR肿瘤中最明显的铁死亡抑制途径与谷胱甘肽（GSH）有关。通过比较GSH循环中核心代谢物的丰度发现GSH相关代谢物在LAR肿瘤中显著富集。在TNBC细胞系中，也证实了LAR亚型中谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽(GSSG)的较高比率。作者还比较了转录组学中LAR和非LAR肿瘤之间的铁死亡抑制途径，进一步证明了GSH代谢是LAR亚型中必不可少的铁死亡抑制途径。在GSH通路的所有代谢基因中，GPX4将LAR肿瘤与非LAR对应物区分开来。于是，作者采用测序进一步验证GPX4的潜在关键作用以及肿瘤细胞对铁死亡的高易感性，发现癌症上皮细胞表达高水平的GSH代谢基因，并在铁死亡方面与其他细胞区分开来。在这种情况下，GPX4抑制剂通常可能靶向肿瘤细胞，并且对免疫细胞的抗肿瘤作用的危害较小。这些数据表明，GPX4是GSH代谢的潜在决定因素，可抑制LAR肿瘤中的铁死亡。研究思路：定位到主角LAR肿瘤对铁死亡最为敏感后，进一步探究抑制LAR肿瘤铁死亡的最主要途径，发现谷胱甘肽的重要作用后，从基因层面进行挖掘，最终发现GPX4。所以作者得出结论：GPX4是GSH代谢的潜在决定因素，可抑制LAR肿瘤中的铁死亡。3、对多种铁死亡诱导剂的独特敏感性凸显了GPX4在LAR肿瘤中的重要性研究者进一步探索了针对LAR肿瘤铁死亡的最佳治疗策略。首先，组装了一组铁死亡诱导剂，包括erastin、PX-12、FIN-56、RSL3和ML162（GPX4抑制剂），以评估每种化合物在启动LAR，非LAR和非TNBC细胞系中的铁死亡的功效。结果发现，在IC50试验中，证明了GPX4在LAR肿瘤铁死亡稳态中的重要性，细胞克隆形成实验进一步确认，LAR肿瘤细胞对GPX4抑制剂的灵敏度最高。研究思路：采用多种铁死亡诱导剂来验证上述所得结论——GPX4可抑制LAR肿瘤中的铁死亡。层层递进，不断深挖，不断验证，为后续实验奠定基础。为了探索导致LAR肿瘤中GPX4表达增加的潜在上游机制，作者采用多组学分析发现LAR的特异性改变与GPX4的表达量呈显著相关性。通过一系列的验证以及抑制剂使用对比，最终发现HEK293T细胞中的AR过表达导致mRNA和蛋白质水平的GPX4表达增加，而敲低AR表达导致MDA-MB-453和MFM-223细胞中mRNA和蛋白质水平的GPX4表达降低，明确了AR为LAR肿瘤中GPX4表达的关键调节因子。接下来探讨了AR调节GPX4的机制——作者发现AR在转录水平上调了GPX4表达。因此，作者采用转录测定和染色质免疫沉淀（ChIP）测定明确了AR与MDA-MB-453和MFM-223细胞中GPX4基因上游的-2500 bp--2000 bp的区域相互作用。此外，作者还探讨了AR是否将GPX4表达作为第二信使来调控。最终得出结论：AR与GPX4启动子结合并驱动其表达。研究思路：明确GPX4对LAR肿瘤的作用后，接下来便是明确其作用机制，作者首先发现GXP4表达差异与LAR特异性表达相关，之后探索了导致GXP4表达差异的上游机制，发现AR，后又探索AR调节GXP4的机制。5、AR在调节铁死亡方面的双重作用表明，对于LAR TNBC患者，靶向GPX4是比靶向AR更好的策略考虑到GPX4是LAR肿瘤铁死亡的潜在抑制因子，AR驱动GPX4的表达，作者想知道AR在LAR肿瘤细胞系铁死亡中的作用。用比卡鲁胺（靶向细胞核中的雄激素相关元素）、达罗他胺（靶向AR核易位）、恩杂鲁胺（靶向AR核易位）和GPX4抑制剂处理MDA-MB-453和MFM-223细胞并分析铁死亡情况，发现GPX4抑制剂而不是AR抑制剂扩大了脂质过氧化水平并增强了铁死亡。先前的研究表明，AR可以通过下调2,4-二烯酰基辅酶a还原酶(DECR1)(一种直接雄激素抑制基因)促进FA代谢，尤其是PUFA积累。此外，还发现添加GPX4抑制剂后，脂质过氧化的生物标志物MDA上调。这些数据证明了AR在铁死亡中的多元作用。一方面，AR可能促进PUFA生物合成以支持铁死亡；另一方面，AR可能会上调GPX4的表达以清除铁死亡过程中的脂质过氧化。因此，抑制GPX4，而不是抑制AR，是LAR肿瘤患者诱导铁死亡的最佳方法。研究思路：明确了整个作用途径后，接下来便是将其与临床结合，提高研究格局，于是作者将目光转移到免疫抑制剂层面，探究AR抑制或GXP4抑制对于患者肿瘤铁死亡的调节作用。在发现AR抑制不理想的情况下，作者还深挖了为什么不理想的原因。6、GPX4抑制剂减少肿瘤生长并重新编程体内肿瘤微环境首先，评估GPX4抑制剂在体内表达AR的TNBC肿瘤中的抗癌作用，发现敲低GPX4表达或添加GPX4抑制剂可显著诱导肿瘤中的铁死亡，但不诱导细胞凋亡。此外，作者还研究了GPX4敲低或GPX4抑制剂对肿瘤微环境的影响，发现抑制GPX4有效地导致PTGS2、MDA和4-HNE(药物诱导的铁死亡的生物标志物)的升高，以及CD3e细胞、CD4细胞、CD8细胞和CD86细胞的聚集，并减少CD206细胞的数量。相关性分析表明，GSH代谢与CD8T细胞和M1巨噬细胞比例呈负相关，而与M2巨噬细胞和静息肥大细胞比例呈正相关。这些数据表明，抑制LAR肿瘤中GPX4表达显著促进铁死亡，减少肿瘤生长，并触发肿瘤微环境获得炎症表型。研究思路：之前的研究以及机制分析都是在细胞层面构建的，那么在动物实验中是否会取得相应的结论。为此，作者采用了两种动物模型，一种是LAR肿瘤模型，一种是免疫冷肿瘤模型，最终得到了相同的结论，实验严谨。7、GPX4抑制剂与ICB联合使用对生物学特征类似于LAR的肿瘤有效为了测试GPX4抑制剂和免疫疗法是否发挥协同作用，构建LAR肿瘤模型小鼠并用GPX4抑制剂或DMSO加PD-1阻断治疗小鼠。结果发现，与单药治疗相比，GPX4抑制剂和抗PD-1抗体联合治疗可显著抑制肿瘤生长，流式结果表示，联合治疗诱导强烈的免疫反应，且PRF1+ CD8T细胞/GZMB+CD8+T细胞的比率大幅升高。此外，联合治疗破坏了不同分支点的GSH代谢。病理结果显示了联合治疗使用的安全性。接下来，作者研究了LAR亚型对GSH代谢的抑制作用是否与两个队列中患者对ICB的临床反应相关。结果发现，AR高表达的TNBC患者表现出增强的铁代谢，且不饱和脂肪酸代谢和GSH代谢活力上升。其中，GSH新陈代谢和肿瘤炎症、STAT1、IFN-γ、PD-1表达量和M1型巨噬细胞的比例呈负相关，但与M2型巨噬细胞的比例呈正相关。Er2GSH代谢与GXP4息息相关，这表明了GXP4在LAR肿瘤中的重要性。由此可得：GPX4抑制剂与ICB的组合是生物学特征方面类似于LAR的肿瘤的最佳治疗方法。研究思路：细胞+动物都得到了证实，那这一发现是否可以对于临床有帮助呢？作者将目光瞄准到免疫治疗，采用抑制剂+免疫治疗药物的方法开展动物实验，最终证实了猜想，并结合临床样本测序，进一步证实猜想，升华研究内容。此篇文章研究思路层层递进——先是采用多组学测序探究TNBC亚型跟铁死亡关系；明确主角后，从细胞角度出发，将整条作用途径明确；之后发展到动物实验，验证所发现的作用途径；最终将目光移到临床治疗，表明后续可能可以采用GXP4抑制剂联合免疫治疗来治疗TNC亚型LAR肿瘤。其研究思路值得借鉴！参考文献：
[1]Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy. Cell Metab. 2023;35(1):84-100.e8.
编辑：小饼干
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