Cancer Discovery 综述 | KRAS激活突变的分类以及对治疗干预的意义

RAS原癌基因家族成员是40多年以前就发现的致癌基因之一，其中KRAS突变是三种RAS家族成员中最常见的。与RAS超家族的其他蛋白一样，KRAS蛋白的GTP水解活性使其能够在信号转导过程中作为细胞表面受体下游的二元开关发挥作用，简单来说，KRAS的核苷酸结合状态决定其激活状态。在没有有丝分裂信号的情况下，KRAS蛋白主要与GDP结合并处于非活性构象，这种非活性状态由内在的GTP水解活性和与GTP酶激活蛋白(GAP)的相互作用来维持，从而加速GTP向 GDP的转化。当细胞表面受体被有丝分裂信号激活时，它们会募集鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)与非活性KRAS结合，催化GDP从活性位点排出，从而被动装载GTP。GTP与KRAS的结合使活性位点从开放构象转变为封闭构象，这种封闭构象促进了KRAS与各种效应蛋白之间的后续相互作用。

RAS GTPase 循环及下游效应通路

在胰腺癌、肺腺癌、小肠和大肠腺癌以及多发性骨髓瘤中KRAS突变频率超过20%，虽然已经鉴定了几种不同的KRAS突变等位基因，但它们的突变频率因肿瘤组织起源而异。在胰腺导管癌中，几乎所有突变都发生在Gly12（G12）；而在肺腺癌、结直肠腺癌和多发性骨髓瘤中异质性更高，还有Gly13（G13）、Ala59（A59）、Gln61（Q61）、Lys117（K117）和 Ala146（A146）等突变。

KRAS基因在肿瘤中的突变频谱

KRAS的胚系突变（germline mutation）会影响发育过程中的RAS/MAPK信号传导，引发许多具有类似临床特征的多系统综合征，包括努南综合征(NS)、心-面-皮综合征(CFCS)，以及罕见的Costello综合征（CS）。临床中把这一系列发育综合征称为“RASopathies”（RAS信号通路相关综合征），其特点是面部畸形、心脏缺陷、身材矮小和骨骼缺陷等。每一种都可能由多种MAPK调节蛋白中的任何一种突变引起，包括SHP2、SOS1、RAF、MEK和GAP 蛋白NF1和p120。在“RASopathies”发育综合征中KRAS突变更为广泛，但这些突变在肿瘤中却很罕见。

我们目前对不同突变对KRAS蛋白生化活性的影响的理解是基于过去40年进行的广泛结构-功能研究的结果，而功能差异方面的生物学验证在过去5年刚刚开始。与最近将BRAF突变分为不同类类似（参考文献；Cancer Discov. 2019;9(3):329-341；关键性研究：Cancer Cell. 2015;28(3):370-383 & Nature. 2017;548(7666):234-238)，2022年3月15日，Dana-Farber 癌症研究所的Kevin M. Haigis等人在《Cancer Discovery》杂志发表题为“Classification of KRAS-Activating Mutations and the Implications for Therapeutic Intervention”的综述，根据目前对KRAS突变的核心生化特性的了解，基于其如何促进激活以及如何影响与不同效应物的相互作用将KRAS突变分为4类（Class 1, Hydrolys; Class 2, Exchange; Class 3, Hybrid; Class 4, to be determined）。

doi/10.1158/2159-8290.CD-22-0035

第1类突变由Gly12（G12）突变组成。Gly12突变是人类癌症中最常见的突变，已有研究表明Gly12的任何突变都会强烈影响GAPs对GTP的加速水解作用（关键性研究：Mol Cancer Res. 2015;13(9):1325-1335），尽管存在例外（非经典GAP蛋白RGS3增强 KRAS蛋白的GTP水解活性，Science. 2021;374(6564):197-201）。许多Gly12突变体也会抑制KRAS蛋白的内在GTP水解。考虑到不同癌症中影响GTPase功能的KRAS突变的频率，损害GTP水解似乎是最有效的致癌激活机制，即增加RAS-GTP的稳态水平进而结合、激活下游效应子。

改编自Nat Rev Drug Discov. 2020;19(8):533-552；数据源于Mol Cancer Res. 2015;13(9):1325-1335（如引用，请注意该图为译者本人绘制，非文献原图）

因此，早期靶向致癌KRAS的一种策略是设计能够被Gly12突变体水解的GTP 类似物以恢复其内在GTP水解能力，从而降低激活蛋白的水平。然而，对突变体水解敏感的GTP类似物从未成为一种具有吸引力的治疗策略，主要是因为RAS对GTP的皮摩尔级亲和力，且细胞中GTP浓度极高 (μM水平)。或者，也有人提出在RAS蛋白活性位点之外设计小分子变构促进或补救这些缺陷突变体的内在GTP水解能力。然而，我们对GTP水解机制的理解仍然不完整而且存在争议。

第2类突变包括Gly13（G13）、Lys117（K117）和 Ala146（A146）以及其他预计类似的突变组成（Ala18、Leu19、Thr20、Gln22、Leu23、Phe28、Asp57、Asn116、Asp119和Lys147突变）。这类突变的主要特征是核苷酸交换能力增强。通过这种机制激活KRAS是可能的，因为释放GDP是一个主动过程，而装载GTP是被动的（参考文献：Science. 2001;294(5545):1299-1304）。

The GEF Reaction, Driving Out the Nucleotide（Science. 2001;294(5545):1299-1304）

由于细胞中的GTP浓度通常高于GDP，因此增加主动的核苷酸释放速率会增加KRAS蛋白被动结合GTP的可能性。Gly13、Lys117和Ala146的突变导致核苷酸交换能力增强中最为显著（参考文献：G13D，Cell Rep. 2019;28(6):1538-1550.e7；A146T，Cancer Discov. 2019;9(6):738-755）。这些位点的突变会增强核苷酸交换（hyperexchange），因为它们会干扰活性位点关闭，同时降低对核苷酸本身的亲和力。此外，这些快速交换突变体可以与GEF协同产生极高水平的交换。然而，这些过度交换突变可能会增强核苷酸交换，使GEF的活性成为消耗品，从而使癌细胞对GEF抑制不敏感（参考文献：Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(12):e2022403118，该研究表明小分子RAS•SOS抑制剂无法解离KrasG13D•Soscat复合物）。因此，需要更深入地研究KRAS蛋白内在的核苷酸交换机制，包括野生型和此类突变体。

Ras^G13D在GDP和GTP结合形式之间循环的机制（Cell Rep. 2019;28(6):1538-1550.e7）

一些2类超交换突变体（hyperexchange）保留了内在的和GAP加速的GTP水解活性。超交换变体的生化特性与其突变的位置一致（GTP γ-磷酸的去除）。与抑制水解的突变体不同，超交换突变很少作为药物靶标受到关注，因为突变频率相对较低。然而，这一类突变可能比此前的认知要大，因为不在活性位点中的KRAS突变也可以通过增强核苷酸交换意外地促进KRAS活化。

第3类突变由Ala59（A59）和Gln61（Q61）以及预计相似的突变（Gly60和Ala66突变）组成。这类KRAS突变体并不完全符合上述两种分类，而是表现出影响 GTPase循环的两个部分的混合表型（GTP水解与核苷酸交换）。比如，Ala59和 Gln61突变位于活性位点的switch II结构域中。这些残基的突变抑制了核苷酸水解并增强核苷酸交换，因为它们与GTP的γ-磷酸接近，并且具有破坏活性位点关闭的能力。

六种常见KRAS突变位点的位置

3类突变也可能意外地影响正常的效应子和调节子的相互作用，例如Q61H（文中表述为Q61K，根据参考文献猜测应为Q61H）。Q61H突变抑制 GAP和内在的GTP水解并适度增加核苷酸交换。它还抑制SOS与KRAS的结合，阻止了核苷酸交换协同增加。最后，Q61H突变增强KRAS对RAF激酶的亲和力，同时减少与PI3K的相互作用。总之，这些生化变化以特定于Q61H突变的方式改变细胞信号传导，因此，表达KRAS^Q61H的肿瘤细胞高度依赖于 MAPK信号传导途径（参考文献：Cancer Res. 2020;80(17):3719-3731）。有趣的是，Q61L突变保留了对GEF功能的敏感性，这表明同一残基上的不同突变可以以独特的方式影响突变蛋白的活性（参考文献：Nat Commun. 2021;12(1):6274）。

第4类突变指的是那些不直接与鸟嘌呤核苷酸相互作用，而是位于蛋白质表面或远离活性位点的突变。这类KRAS突变的生化特性有待研究[to be determined (TBD)]，但这些突变有可能广泛地影响KRAS的功能，包括对效应蛋白和调节蛋白的亲和力、核苷酸交换率以及KRAS达到催化活性构象的能力。毫无疑问，这些突变的影响（如果有的话）是不易察觉的，因此它们很少在癌症中发现。相反，这些突变在KRAS胚系突变中更为常见，特别是非致病性突变。这些突变是否/如何影响KRAS的激活肯定会导致对KRAS功能的更深入的理解。

每种突变密码子在KRAS蛋白序列和功能域中的位置

在没有直接靶向KRAS抑制剂的情况下，抑制KRAS的努力集中在RAS下游通路上。在已报道的RAS下游信号中，MAPK和PI3K对RAS的功能尤为重要，并且已经成为KRAS靶向药物开发的焦点。

KRAS突变细胞下游效应通路的激活取决于：

(i) 细胞中KRAS-GTP水平，

(ii) 突变KRAS对效应蛋白的亲和力，

(iii) 调控因素，如通路蛋白的表达和正、负反馈调节。

就KRAS与直接效应蛋白的结合水平来看，致癌体细胞突变和遗传性发育突变都会改变与效应蛋白的结合，有时相同密码子的不同突变之间还存在差异（比如G12V、G12D、G12C)。推而广之，每种KRAS突变都能独特地改变下游信号。例如，G13D相比G12D是更弱的致癌等位基因，在小鼠结肠上皮细胞中诱导过度增殖表型要弱一些。尽管G13D突变的超交换特性允许GTP 结合KRAS的稳态水平增加，但该突变通过降低对RAF激酶的亲和力限制了KRAS的致癌性。同样，与G12D相比，G12R在小鼠胰腺中引发肿瘤的能力显著降低，因为G12R突变无法通过结合和激活p110α来驱动巨胞饮作用。

靶向KRAS下游通路（主要是MAPK和PI3K通路抑制剂）在临床上基本都失败了，由于单一疗法的耐药性和联合疗法的毒性。比如，MEK抑制剂（cobimetinib 和trametinib）在KRAS突变肿瘤中疗效较差，部分原因是它们同时抑制了ERK 介导的反馈抑制。在KRAS突变存在的情况下，缺乏ERK对RAF的反馈矛盾地促进了MEK过度激活，导致MEK抑制的突破和ERK的重激活。

考虑到每种KRAS突变的独特特性的治疗策略可能会更成功。例如，G12R突变不能激活PI3K，而PI3K信号传导会导致MAPK耐药，因此这些肿瘤可能对 MAPK通路抑制剂比其他突变更敏感。因此，治疗不同KRAS突变肿瘤需要考虑其特定的信号传导能力（独特的生化、生物学特性），并靶向其必需的下游通路。

虽然这种方法在理论上是合理的，但它无法解释组织特异性生化和遗传特征对 KRAS信号传导的影响。例如，KRASG12D突变诱导显著不同的下游信号模式，这取决于起源组织和是否存在其他突变。正如前所述，每种肿瘤的KRAS突变频谱不同。此外，每种KRAS突变的共突变模式因肿瘤的组织起源而异（参考文献：Nat Commun. 2021;12(1):1808）。因此，不同KRAS突变的生化特性反映在不同细胞谱系产生的癌症所特有的遗传网络中。

因而，KRAS突变对下游通路的激活还应考虑：

(iv) 共突变类型，

(v) 肿瘤组织起源。

这种复杂性使得难以直观地判断哪些下游靶向抑制剂对KRAS突变肿瘤是有效的，这也是不可能的。

过去的观点认为，KRAS蛋白在GDP/GTP循环中发挥二进制的开/关作用。但这一概念过度简化了单个分子的核苷酸状态以及由此产生的动态蛋白质构象之间的复杂相互作用，这对于每种突变都是独特的。每个KRAS突变体的构象状态决定了细胞中整个KRAS蛋白的活性状态。

综述最后，作者提到根据不同KRAS突变对GTP水解、核苷酸交换和效应蛋白相互作用的影响将其分为4类。但还应考虑组织和细胞类型特异性因素，比如胞外信号、GAP和GEF的表达和定位模式、效应子的表达模式和结合亲和力以及两种KRAS剪接体（KRAS4A和KRAS4B）的细胞分布。

每类KRAS突变的一般特征及其对癌症体细胞突变RASopathies中的胚系突变和人类基因组SNP的贡献。（箭头表示生化特性变化的方向和幅度）

在G12C特异性抑制剂方面取得的成功证明基于每种突变的独特生化特征开发靶向疗法的努力是合理的。KRAS^G12C抑制剂利用半胱氨酸与GDP结合的KRAS共价结合，将KRAS蛋白锁定在非活性构象中。令人惊讶的是，虽然G12C突变对经典的GAP诱导的GTP 水解不敏感，但它保留了内在的GTPase活性并对非经典GAP（RGS3）诱导的水解敏感，这对于维持GDP结合KRAS^G12C pool并摆脱受体酪氨酸激酶的激活是至关重要的。最近，有研究验证了通过与Asp12形成盐桥来开发G12D特异性抑制剂的概念策略。

鉴定每类突变的共同特征也许可以扩展同一类突变的治疗策略。比如，EGFR抑制剂对G13D突变的转移性结直肠癌有效，而不是 Gly12。确定其他2类突变的转移性结肠直肠癌对EGFR抑制剂是否敏感将很有趣。