无PAM限制，通用型PRIME编辑治疗眼科疾病，基因编辑迎来3.0时代

这两年，基因编辑疗法的临床试验先后遭遇搁置，体内环境对CRISPR递送的阻碍、在进行基因编辑时需要DNA双键断裂带来的安全性风险都使得部分研究人员将视野投向新的编辑技术。不过，这并不意味着CRISPR基因编辑技术面临着被时代淘汰的风险，相反，许多新的基因编辑系统自CRISPR系统的基础上被开发出来，并且取得了不小的进展。

2023年3月17日，武汉科技大学姚凯教授团队在Journal of Experimental Medicine上发表了一篇题为“Vision rescue via unconstrained in vivo prime editing in degenerating neural retinas”的研究性论文，构建了一种新的、通用型CRISPR系统——PESpRY，通过双AAV载体递送这种将先导编辑（Prime Editor）与无PAM序列限制的spCas9突变体SpRY结合的CRISPR系统，研究人员成功治疗了PDE6B基因突变的视网膜色素变性（RP）小鼠模型。

视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa，RP）是一种进行性、遗传性、营养不良性退行性病变，主要是由视网膜神经感光细胞相关基因突变引起，致病的基因突变可能超过100种，随着疾病进展，患者将出现严重的、不可逆的视力恶化以及失明，是人类失明的主要原因之一。

此前，研究人员基于CRISPR-Cas系统成功在IRD的基因治疗中实现了靶向基因组的基因编辑；随后，先后有科学家成功使用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）纠正rd65小鼠视网膜色素上皮（RPE）中Rpe12位点的无义点突变，但碱基编辑只能对单个突变碱基进行针对性编辑；刘如谦在2019年开发的先导编辑（Prime Editor，PE）可以在没有DNA模板的情况下实现所有12种单碱基的自由转换，这种基因编辑技术成功在rd12小鼠中有效纠正Rpe65基因中的点突变。

不过，这些实践均针对视网膜色素上皮细胞，视网膜色素变性主要由视网膜神经感光细胞相关基因突变引起；而遗传性视网膜疾病的特定基因突变位点附近不一定具有基因编辑工具酶（Cas蛋白）所需的原间隔相邻基序（PAM）序列，也会给CRISPR基因编辑系统的使用造成一定的障碍。

在本篇文献中，研究人员使用的无PAM序列限制的spCas9突变体SpRY在2020年被开发，与先导编辑结合后开发了一种基因组编辑工具，将PE的多功能性和SpRY的无PAM限制相结合，可以通过编程来编辑多种不同类型的基因突变，不受其在基因组中未知的限制。

研究人员构建了靶向突变PDE6β基因的PESpRY系统，通过基于分裂的Npu内含肽的双AAV系统将该编辑器以及配对的gRNA递送至Pde6brd10小鼠（一种著名的RP小鼠模型）中，证明了PESpRY系统可以在无需NGG PAM（GTG）的情况下、通过两种类型的编辑（Pde6bT到C和Pde6bAGA）有效地纠正突变，恢复PDE6β酶活性，防止杆状细胞和锥状细胞死亡，并恢复了小鼠对光的正常电反应。

CRISPR基因编辑系统由切割蛋白和一个短基因序列配对组成，Cas9识别PAM域将Cas9/sgRNA复合物定位至目标，引起目标区域双链DNA的解旋，随后解旋DNA经sgRNA引导形成R-Loop环，Cas9切割DNA链并通过非同源性末端连接（NHEJ）或同源介导修复（HDR）完成基因编辑。

这一技术发展至今仅仅过去十年，但已经在相当广阔的领域得到了应用，其相关技术也在飞速向前发展，不过，正如前文中提到的，基于这种系统的第一代CRISPR基因编辑疗法的局限性也逐渐浮现了出来。相较而言，NHEJ修复占比更多，但其随机性可能会造成碱基插入或缺失，引入HDR模板的修复方式则效率相对较低。

目前，大多CRISPR疗法都基于第一代CRISPR技术，包括即将上市的首款CRISPR基因编辑疗法、Vertex和CRISPR的Exa-cel，这些集中于镰状细胞病与β地贫治疗领域的基因疗法大多采用“破坏”DNA的方式进行治疗，破坏原有的致病基因或是解除原本的抑制作用来生成正常的功能性蛋白，但这也会带来一定的安全性风险。

这里所说的更加安全有效的“第二代”CRISPR基因编辑疗法，是指不会造成DNA双键断裂的碱基编辑与先导编辑。

碱基编辑由刘如谦（David Liu）团队研发，衍生于CRISPR/Cas系统，在其基础上引入了碱基转变酶，同时将原本的Cas酶替换成了失活的核酸酶，这种酶不具有双链切割活性，可以对双链DNA进行定位解旋，无需DNA双链断裂即可修复单碱基突变。

▲ ABE工作原理 图源：参考资料2

在这一基础上，先后出现了多种类型的碱基编辑器，包括刘如谦在2017年开发的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、将dCas9替换成D10A突变的nCas9后的碱基编辑器、使用尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG）作为碱基转变酶的CGBE、J. Keith Joung发明的双碱基编辑器SPACE等等。

尽管不会造成DNA双键断裂，碱基编辑也有自己的局限性。碱基编辑器同样受到Cas靶向范围的限制，同样需要原间隔相邻基序（PAM）；目前的碱基编辑器只能实现12种可能类型的点突变中的6种，无法完成基因的插入、删除与倒置；由于碱基编辑器在4-5个核苷酸（nt）的小窗口内脱胺，邻近目标位点的核苷酸也可能会被编辑，称为“bystander editing”，研究人员也在尝试不同的方案来克服目前的局限。

先导编辑器包含Cas9-H840A切口酶（nCas9）与逆转录酶（RT）形成的融合蛋白以及所需编辑序列的pegRNA，同样由刘如谦团队开发，也被称为第三代基因编辑技术，可以在不造成DNA双链断裂的情况下，完成特定碱基的替换、插入和删除。pegRNA包括了sgRNA、引物结合位点（PBS）与逆转录模板（RTT），通过内源性DNA错配修复系统完成基因编辑。

▲ PE工作原理 图源：参考资料2

这种编辑系统可实现12种碱基的任意替换，以及多达44个碱基的插入对和多达80个碱基对的删除，但对于大序列的替换或缺失的编辑效率相对较低，整体的编辑效率也低于碱基编辑。在这种情况下，有不少拓展编辑范围、提升编辑效率的尝试，例如刘如谦和殷昊等课题组的双pegRNA策略、刘如谦课题组开发的包含MLH1dn蛋白的新型先导编辑器、以及陈佳等课题组在pegRNA的RTT中规律性的引入同义突变等。另外，有研究者尝试将先导编辑与DNA重组酶结合的方式来完成大片段DNA的插入，分别是刘如谦和Abudayyeh-Gootenberg课题组的twinPE以及PASTE技术。

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先导编辑面临的问题是，其总大小超过了8.3kb，超过了AAV病毒的包装上限，尽管双AAV系统有望实现编辑器的递送，但这种编辑器的表达还需启动子、BGHpA和WPRE等元件，也接近双AAV系统的递送上限，小型Cas酶或许将为这一问题带来新的解决方案。

CRISPR基因编辑无疑将成为未来的热门领域之一，也将为许多疾病带来新的解决方案。目前，国内已有多家企业在布局新一代的CRISPR编辑系统，例如，新芽基因在两个月前获得新一轮融资，推进碱基编辑治疗管线；邦耀生物与高校合作发现了高精度新型胞嘧啶碱基编辑系统；正序生物科学创始人团队创建的变形式碱基编辑系统tBE（transformer Base Editor）正式获得了美国专利商标局专利授权；贝斯生物合计已申请及许可十多项碱基编辑和先导编辑专利等等，整体进度与国际顶尖水平不相上下。相信在将来，国内的基因编辑企业将在这一领域大放异彩。

参考资料：

1.Huan Qin, Wenliang Zhang, Shiyao Zhang, Yuan Feng, Weihui Xu, Jia Qi, Qian Zhang, Chunxiu Xu, Shanshan Liu, Jia Zhang, Yushuang Lei, Wanqin Liu, Shuyu Feng, Jingjing Wang, Xuefei Fu, Zifen Xu, Ping Li, Kai Yao; Vision rescue via unconstrained in vivo prime editing in degenerating neural retinas. J Exp Med 1 May 2023; 220 (5): e20220776. doi: https://doi.org/10.1084/jem.20220776

2.Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). https://doi.org/10.1038/nature17946

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