《癌细胞》：川大华西医院团队发现膀胱癌耐药新机制，有望破解实体肿瘤分化治疗困局！
*仅供医学专业人士阅读参考
膀胱癌是全球最常见的癌症之一，每年有50多万新增病例，其中约40%死于此疾病，肌层浸润性膀胱癌（MIBC）是最常见和最致命的膀胱癌类型[1]。
尽管，靶向治疗和免疫治疗在膀胱癌治疗方面取得了一些进展，但基于顺铂的化疗仍是不可切除和转移性MIBC的一线治疗方案[2]。然而，不幸的是大多数患者或早或晚会产生化疗耐药。目前肿瘤化疗耐受的分子机制并不明确，克服MIBC化疗耐药成为研究人员迫切需要解决的重要问题。
近日，由四川大学华西医院陈崇、刘玉和魏强领衔的研究团队，在著名期刊Cancer Cell杂志上发表重要研究成果，发现膀胱癌耐药新机制。
他们发现肿瘤细胞半鳞状分化是膀胱癌化疗耐药的一个新特征。具体来说，组织蛋白酶H（CTSH）与化疗耐药和半鳞状分化有关，使用CTSH抑制剂（E64）可以激活肿瘤坏死因子（TNF）通路，诱导肿瘤细胞终末鳞状分化和细胞焦亡，进而特异性抑制化疗耐药肿瘤的生长[3]。
这个研究有望给实体肿瘤的分化治疗提供新思路。华西医院的王漫丽博士、陈雪兰博士、谭平博士、博士研究生王怡匀为共同第一作者。
论文首页截图
接下来，我们一起看看这项研究是如何开展的。
首先，研究团队构建了原发、原位MIBC小鼠模型，该模型具有MIBC患者的临床病理特征，对化疗方案（顺铂+吉西他滨）的反应与临床相似，并且可以呈现复发耐药的全过程。
接下来，研究团队基于该模型对化疗敏感肿瘤和耐药肿瘤分别进行单细胞RNA测序，发现两种肿瘤中的肿瘤细胞并不相同，研究人员把化疗敏感肿瘤中的主要肿瘤细胞命名为T1，化疗耐药肿瘤中的主要肿瘤细胞命名为T2。
小鼠化疗敏感（Sen）和化疗耐药（Res）肿瘤的单细胞RNA测序分析的t-SNE图
蓝色代表T1细胞；红色代表T2细胞
随后，研究人员使用流式细胞术分别分离出了化疗敏感肿瘤和耐药肿瘤中的T1和T2细胞，以Sen-T1、Sen-T2和Res-T1、Res-T2表示。
有趣的是，这四种细胞的化疗耐药性逐渐增加，研究人员利用这四种细胞计算出化疗耐药轨迹，沿着轨迹动态表达的基因被识别并分为四个模块，肿瘤细胞鳞状特征基因表达沿着轨迹逐渐上调。
与敏感肿瘤相比，耐药肿瘤中与鳞状分化相关的多个基因集显著富集，大多数干细胞相关基因集在T2细胞中表达下调。
这些结果表明，肿瘤细胞鳞状分化与膀胱癌获得性耐药有关。
耐药轨迹的构建及相关基因富集分析
为了测试化疗敏感的T1细胞是否能转化为化疗耐药的T2细胞，研究人员使用DNA编码示踪技术标记化疗敏感性肿瘤细胞，并将其移植到受体小鼠体内。
14天后，分离纯化小鼠肿瘤中的T1、T2细胞，然后进行深度测序。结果显示，T1细胞群中65.9%的编码出现在了T2细胞群中。这些结果在肿瘤类器官及小鼠体内得到了进一步验证。
以上结果表明，肿瘤细胞谱系可塑性是MIBC获得性耐药的重要途径。
肿瘤细胞谱系可塑性
接下来为了模拟临床治疗中的多轮化疗，研究人员对小鼠化疗敏感肿瘤进行了一系列化疗。
RNA测序和RT-qPCR显示，与化疗敏感肿瘤相比，顺铂联合吉西他滨治疗两次的肿瘤细胞鳞状细胞特征基因上调，而与治疗两次的相比，治疗四次的肿瘤进一步上调。组织学分析显示，肿瘤细胞在多轮化疗后逐渐发生鳞状分化。
为了进一步确定MIBC化疗耐药的关键蛋白，研究团队通过蛋白质组学分析发现，与敏感肿瘤相比，耐药肿瘤中的多种鳞状细胞分化相关通路表达明显上调。其中，CTSH（一种溶酶体蛋白水解酶在多种人类肿瘤中高表达[4]）在小鼠和人类的肿瘤组织中随着化疗耐药轨迹逐渐表达上调，并且在接受多轮化疗的肿瘤中，CTSH在mRNA和蛋白水平表达均逐步增加。
这些数据表明，在MIBC中CTSH表达与化疗耐药相关。
CTSH表达上调是MIBC化疗耐药的关键蛋白
小鼠体内试验表明，干扰CTSH的表达后，移植到小鼠体内的肿瘤明显小于对照组肿瘤，并且肿瘤细胞死亡增加，肿瘤细胞密度降低。
在体外，CTSH过表达的肿瘤类器官的生长与对照组肿瘤细胞生长相似，然而在移植到小鼠体内，CTSH过表达的肿瘤在化疗后复发更早，生长速度更快。同时，CTSH过表达可显著增加鳞状分化相关基因Krt5和Krt14的表达。
以上结果表明，CTSH在MIBC化疗耐药过程中起着至关重要的作用。
CTSH对肿瘤的鳞状分化和肿瘤生长的作用
那么使用抑制剂E64抑制CTSH的活性对肿瘤有哪些影响呢？
首先，研究人员用E64分别处理化疗敏感和化疗耐药膀胱癌类器官，发现化疗耐药类器官对E64的反应明显高于化疗敏感类器官，表现为E64治疗组小鼠的膀胱明显小于对照组。
同时，E64治疗还可以显著抑制移植到受体小鼠皮下的耐药MIBC肿瘤，相比之下，E64对化疗敏感肿瘤的生长没有显著影响。
E64对膀胱癌生长的影响
接下来，病理分析显示，E64治疗的肿瘤出现大面积角化珠，同心角蛋白沉积层，周围有分化的角质形成细胞样细胞增生。
免疫荧光染色显示，E64治疗的肿瘤细胞大部分表达鳞状细胞终末分化的特异性标记物正外膜蛋白（Involucrin），剩余的那部分细胞细胞角蛋白16表达阳性（CK16），而在对照组肿瘤中正外膜蛋白表达完全缺失。
基因富集分析显示，与对照组肿瘤相比，E64治疗肿瘤中富集的所有顶部通路都与角化有关，这与病理分析一致。蛋白质组学分析显示，与化疗敏感肿瘤相比，耐药肿瘤中鳞状细胞分化相关基因的蛋白水平轻度增加，并且通过E64治疗进一步增加。此外，化疗耐药肿瘤的鳞状细胞组合特征明显高于敏感肿瘤，且经E64治疗后进一步显著增加。
为了区分耐药MIBC细胞的鳞状分化和E64治疗后的鳞状细胞分化，研究团队将化疗敏感细胞到耐药细胞的谱系转变命名为“半鳞状化”。
scRNA序列分析显示，E64治疗后的耐药肿瘤中出现了新的肿瘤细胞亚群，这个亚群的肿瘤细胞表达高水平的终末鳞状细胞分化标志物，被命名为T3。这表明，半鳞状分化与MIBC的化疗耐药性密切相关，CTSH抑制可促进其完全鳞状分化。
抑制CTSH诱导耐药MIBC的终末鳞状分化
那么对于耐药MIBC的患者是否可以进行诱导分化治疗呢？
为了测试E64对人类MIBC的潜在分化治疗效果，研究人员用NSG小鼠（患者7-9）中MIBC患者的肿瘤细胞建立人源肿瘤组织移植（PDX），患者7和8的PDX表达高水平的CTSH，与获得性耐药患者6的PDX肿瘤相似，而患者9的PDX肿瘤为CTSH表达缺失。
一直以来，患者7和8的肿瘤对化疗几乎没有反应，而患者9的肿瘤则被完全抑制；E64治疗后可显著抑制患者6、7和8耐药肿瘤的生长，而对患者9的化疗敏感性肿瘤的生长没有显著影响。
有趣的是，这些化疗耐药MIBC PDX肿瘤在E64治疗后出现大面积角化珠，提示终末鳞状细胞分化。免疫荧光染色显示，E64治疗的PDX表达高水平的正外膜蛋白，而对照组耐药PDX不表达。
这些结果表明，E64可通过诱导肿瘤细胞终末鳞状分化特异性抑制化疗耐药的MIBC。
E64特异性抑制人类耐药MIBC
在研究的最后，研究人员探讨了靶向抑制CTSH治疗耐药膀胱癌的分子机制。
基因集富集分析显示，与对照组肿瘤相比，接受E64治疗的肿瘤TNF信号通路在转录和蛋白水平上显著上调。在小鼠体内，TNF-α中和抗体英夫利西单抗可以完全阻断E64治疗对化疗耐药肿瘤的作用。
研究人员还发现，TNFR1（TNF-α受体1）缺失可显著降低E64的体内抗肿瘤活性，角化珠的形成被完全阻断；相反，TNFR1缺失对化疗耐药肿瘤的鳞状分化影响极小。
这些数据表明，TNF途径对E64治疗诱导的化疗耐药MIBC的终末鳞状分化至关重要。
阻断TNF途径对E64治疗化疗耐药MIBC的终末鳞状分化
同时，研究人员还发现，E64治疗的耐药肿瘤中裂解活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase 8）和GSDMC表达增加，CTSH缺失也增加了Caspase 8和GSDMC的裂解活化。
已有研究表明，TNF通路通过激活caspase 8诱导细胞焦亡[5]。在E64治疗的化疗耐药肿瘤中，英夫利西单抗完全消除了GSDMCs和caspase 8的裂解；TNFR1缺失可显著降低E64治疗肿瘤中GSDMC的水平。
这些数据表明，caspase 8激活的细胞焦亡对于CTSH-TNF-α/TNFR1介导的耐药膀胱癌分化治疗至关重要。
模型示意图
总的来说，这项研究从构建精准动物模型入手，发现半鳞状分化是MIBC获得性化疗耐药的新特征，肿瘤细胞谱系可塑性是MIBC获得性耐药的主要途径；通过基因富集、蛋白质组学分析等揭示了CTSH是耐药性产生的关键蛋白，与MIBC的半鳞状化密切相关，进而提出了耐药膀胱癌新的治疗靶点CTSH，通过抑制CTSH可诱导这些半鳞状化肿瘤细胞通过TNF途径导致终末鳞状分化和细胞焦亡。
这一研究探索了膀胱癌化疗耐药的新机制，为实体瘤分化治疗带来了新的思路。
参考文献：
1.Tran L, Xiao JF, Agarwal N, Duex JE, Theodorescu D. Advances in bladder cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 2021;21(2):104-121. doi:10.1038/s41568-020-00313-1
2.Rouprêt M, Babjuk M, Compérat E, et al. European Association of Urology Guidelines on Upper Urinary Tract Urothelial Carcinoma: 2017 Update. Eur Urol. 2018;73(1):111-122. doi:10.1016/j.eururo.2017.07.036
3.Wang M, Chen X, Tan P, et al. Acquired semi-squamatization during chemotherapy suggests differentiation as a therapeutic strategy for bladder cancer. Cancer Cell. 2022;40(9):1044-1059.e8. doi:10.1016/j.ccell.2022.08.010
4.Olson OC, Joyce JA. Cysteine cathepsin proteases: regulators of cancer progression and therapeutic response. Nat Rev Cancer. 2015;15(12):712-729. doi:10.1038/nrc4027
5.Broz P, Pelegrín P, Shao F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation. Nat Rev Immunol. 2020;20(3):143-157. doi:10.1038/s41577-019-0228-2
责任编辑丨BioTalker