“站在CRISPR肩膀上”的体内RNA编辑：精准医疗的下一个明星赛道
2023年3月27日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--近年来，基因编辑疗法的热度逐渐升高，入局这一领域的企业只增不减，全球首款CRISPR/Cas9基因编辑疗法，CRISPR Therapeutics和Vertex合作开发的exa-cel也将在不久后完成上市申请，更是将赛道进一步向前推进。不过，基因编辑疗法在发展路上并非一帆风顺，几家创新药企的临床管线被先后搁置，究其原因，无外乎是安全性仍需要进一步确定。
目前，企业和研究人员均在积极探索新的基因编辑方式，最初的CRISPR/Cas9基因编辑需要引入外源的编辑系统和剪切酶，需要先引发DNA双键断裂才能完成对于致病基因的修改。近年来，DNA碱基编辑器逐渐兴起，提供了一种不会导致DNA双键断裂、更安全的基因编辑方式。可是，所有的DNA编辑均可能诱发可遗传的、永久性的脱靶突变，对于患者的后续观测需要持续很长一段时间。
在这种情况下，不会改变患者基因组、又能产生正常功能性蛋白质的RNA编辑自然走入了研究人员的视野。除此之外，RNA编辑也无需进入细胞核便可完成编辑，可以在一定程度上避免DNA编辑所带来的潜在安全和伦理问题。早在1995年，Ribozyme Pharmaceuticals公司的研究人员就发现，反义寡核苷酸可以募集内源性ADAR酶(RNA腺嘌呤脱氨酶)到互补RNA链上进行碱基编辑，首次提出了“治疗性RNA编辑”这一说法，该研究结果在PNAS杂志上发表。
虽然RNA编辑具有一定的安全性优势，但RNA编辑工具的脱靶效应仍存在安全隐患，仍需拓展新型RNA编辑工具，以此开发更具特异性和安全性的RNA编辑器。近两年有关于RNA编辑的研究越来越多，总体而言，这些RNA编辑器可以分为两类，分别是：
1.基于CRISPR/Cas13系统的RNA精准编辑；
2.借助内源性ADAR酶实现的精准编辑。
本文将针对这两种编辑系统的研究进展、优势与挑战进行全面梳理分析，内容丰富，请耐心阅读，建议收藏！
CRISPR/Cas13
CRISPR/Cas9在CGT治疗领域取得了极大的成功，但一方面，DNA疗法仍存在一定的局限性；另一方面，Cas9以及Cas9依赖的基因编辑工具的专利限制了其他企业的使用。2015年，Eugene Koonin实验室和张锋团队合作，在微生物宏基因组数据库中发现了Cas13a（c2c2），Cas13b（c2c6）和Cas13c（c2c7）三种系统，并证实了其敲低RNA的能力。与靶向DNA的Cas9不同，Cas13可以在crRNA的引导下降解目标RNA，被广泛应用于RNA敲低、RNA单碱基编辑、RNA定点修饰、RNA活细胞示踪等多个领域。
➤ 2017年，张峰实验室发现Cas13a和Cas13b可在引导RNA（sgRNA）的作用下对RNA进行切割编辑，将Cas13b与ADAR2腺苷脱氨酶结构域融合，成功构建了一个RNA敲低和编辑平台，成功在哺乳动物的细胞中实现了RNA编辑。
不过，与CRISPR/Cas9类似，CRISPR/Cas13同样因为尺寸太大，无法装入AAV这一目前最成熟有效的体内基因治疗病毒载体中进行递送，难以对患者进行体内给药。因此，找到尺寸更小的Cas13酶变成了后来最主要的研究方向之一。
➤ 2018年，美国两位研究人员Patrick D Hsu和David A Scott分别在Cell和Molecular Cell上同时报道了Cas13d系统，Cas13d蛋白较常见的Cas蛋白减少了100到200个氨基酸。
➤ 2021年5月，杨辉团队在Nature Methods发表了一篇题为“Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes”的研究性论文，发现了两类新的CRISPR/Cas13系统：Cas13X和Cas13Y，其中Cas13X.1蛋白比RfxCas13d蛋白小将近200个氨基酸，并且展示了与其相似的高活性和高特异性。将突变的dCas13X.1与ADAR2dd融合并进行蛋白截短改造后，研究人员开发了一种迷你型的RNA单碱基编辑工具，可以对靶RNA进行高效的A>I和C>U的编辑，这种小型编辑器可以包装到一个AAV病毒载体。
➤ 2021年8月，张锋团队再次发现了一种Cas13酶的变体，Cas13bt，其尺寸只有其它Cas13酶的一半大小，这种超小型的Cas酶可以被装进单个AAV病毒中，与张锋实验室之前开发的两个RNA编辑工具REPAIR和RESCUE结合后，可以成功修改RNA，这项Cas13研究工作已经授权给了Beam Therapeutics。
在解决了尺寸与递送问题之后，提高安全性变成了RNA编辑系统的又一问题。Cas13酶具有独特的旁系切割活性，在crRNA和目标RNA同时存在的情况下，可能会随机切割体系中其他的单链RNA（ssRNA），在应用于治疗领域时有概率引起致命的毒副作用。
➤ 2022年8月，杨辉团队在Nature Biotechnology上发表了题为“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的研究性论文，研究人员发现了一种高保真Cas13突变体（hfCas13d），显著降低了旁系切割活性。
至此，基于CRISPR/Cas13酶的RNA编辑的下一个目标，变成了提高Cas13系统在大动物上的编辑效率，降低达到有效治疗效果的最低剂量。
内源性ADAR酶
CRISPR/Cas13系统可以实现RNA的精准编辑，但仍需要借助外源性的Cas13蛋白，在这种系统中被利用的ADAR 腺苷脱氨酶本身就可以实现RNA中腺苷到肌苷（A>I）的精确编辑，肌苷被细胞的翻译机器解读为鸟苷（G），因此这也成为了主流的研究方向之一。目前，在哺乳动物中已经鉴定出了三种ADAR蛋白：ADAR1（isoform p110和p150）、ADAR2和ADAR3。
ADARs介导的RNA编辑依赖于两种成分，即向导RNA（adRNA/gRNA）和ADAR蛋白，gRNA负责将ADAR招募到目标RNA序列处并且完成编辑。传统的gRNA利用细胞中的天然ADAR方面效率不高，内源性ADAR表达量相对较少，需要依赖外源性ADAR酶及其变体来提高效率，而ADAR的过度表达又会引入过多的非靶向编辑，还可能导致蛋白质相互作用的改变，进一步影响细胞生理学。
因此，这种技术路线的主要研发领域之一，就是研发改造新的gRNA。
➤ 2019年，北京大学魏文胜课题组研发出了借助gRNA募集ADAR实现RNA精准编辑的新策略：LEAPER™。LEAPER™通过在细胞中表达短工程化的ADAR募集RNA（ADAR-recruiting RNA，arRNA）来完成ADAR的招募以及RNA编辑，不过这种技术彼时尚不成熟，具有一定长度的arRNA可能引起邻近的碱基的脱靶编辑。
➤ 2022年1月，德国图宾根大学的研究人员对gRNA进行了优化改造，并且开发出同样利用ADAR、无需外源蛋白的新策略--CLUSTER。LEAPER和CLUSTER两种策略拥有相近的RNA精准编辑效率，不过，CLUSTER策略在邻近位点的脱靶率上具有一定的优势，没表现出明显的邻近碱基脱靶。
➤ 2022年2月，魏文胜教授实验室在Nature子刊发文，题为“Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo”，报道了LEAPER™的升级版本——LEAPER™ 2.0，设计并运用了可招募ADAR的环形RNA（circular ARAR-recruiting RNA，circ-arRNA），通过AAV递送，遗传编码的circ-arRNA可以在人的原代细胞和类器官中实现长时程的RNA编辑，这种可避免核酸外切酶切割的环状RNA进一步提升了体外和体内编辑的效率和精准性，基本清除了双链RNA区域内目标转录本上的脱靶。
➤ 2022年6月，美国加州大学Prashant Mali团队在Nature Biotechnology上发文，研究人员设计了一种高度稳定的环状向导RNA（cadRNA），经体外验证编辑效率后，通过AAV8递送单拷贝和双拷贝cadRNA，实现了招募内源性ADAR，并且进一步完成了体内RNA编辑。
➤ 2023年3月11日，Nature子刊发表了一篇题为“Autocatalytic base editing for RNA-responsive translational control”的文章，介绍了一种名为DART VADAR的传感器，通过与RNA编辑器相结合，经正反馈回路放大了内源性ADAR编辑信号，小于5kb的大小（包括启动子和终止子）便可以触发自催化，扩大了RNA编辑的应用空间。
小结
基因编辑本身作为一种新技术，在走向商业化的途中日趋完善，也将覆盖多种此前缺乏有效治疗手段的疾病。RNA编辑这一细分的基因编辑治疗领域仍处在相对早期的探索阶段，其临床前研究和研究性论文的数量在近两年不断涌现，似乎在从0到1的增长后出现了一点爆发式增长的征兆，礼来等巨头也不惜投入巨额资金在这一领域内布局。或许，这种更安全、更稳定的基因编辑方式将成为精准医学的下一个热门赛道之一，在现有的“巨人”——CRISPR技术的基础上，进一步将基因编辑疗法推向更多疾病治疗领域。
推荐阅读：RNA编辑新锐牵手LNP龙头，基因编辑疗法新来细分领域新格局
基因治疗系列文章一览
2、AAV商业化之路
10、AAV基因疗法罕见病领域
11、国内AAV疗法监管法规
12、AAV载体优化策略(上)
系列长图文章一览