【前沿速递】DMD微小抗肌萎缩蛋白基因疗法及其一项首次人体临床试验

随着DMD病情进展，肌纤维的完整性遭到破坏，进而引发肌纤维坏死、肌肉纤维化，缺少积极治疗的情况下，患者约在12岁丧失行走能力，直至二三十岁时因累及呼吸肌、心肌系统而面临死亡。相比于现有的激素类主流对症治疗，DMD基因疗法属于对因治疗，旨在恢复人体自身的抗肌萎缩蛋白的表达水平。近年来，DMD基因治疗的临床研究业已取得显著进展，如无义突变通读治疗 （口服 PTC124）和外显子跳跃治疗（将移码突变转变为整码突变），但这两种治疗方法仅针对特定的基因突变患儿。

与此不同，微小抗肌萎缩蛋白基因治疗是指提取部分Dys基因，创建一个保留蛋白功能的微小抗肌萎缩蛋白基因(microDys)，再以AAV病毒载体递送至肌肉靶组织，促使肌肉生成微抗肌萎缩蛋白；理想上可适用于所有突变类型的患儿，且仅需单次静脉注射即可改善症状。此疗法治疗流程与AAV介导的基因治疗并行发展，历经50余年的技术改进，目前已有多项临床试验陆续启动；个中差异在于选择的腺相关病毒载体血清型、microDys基因型、采用何种基因启动子，以及受试者年龄等方面^[1]。

本篇涉及的疗法代号为rAAVrh74.MCK.GALGT2，利用重组腺相关病毒血清型rh74（raavrh74）为载体，转基因片段为GALGT2，又称B4GALNT2，主要在骨骼肌和心肌特异性启动子MCK的控制下表达。前期小鼠和犬科DMD动物模型的研究显示其在抑制肌肉病理学发展、防止心脏功能丧失等方面的临床价值。在这项首次人体临床试验中，仅完成２例DMD患者（表１）的治疗，采用隔离肢体灌注（ILI）方法将病毒载体输送到两条股动脉，评价疗法的安全性及疗效相关的多重层面。

表1. 入组接受治疗的2例DMD患者

• 不良事件

接受治疗的2例患者对隔离肢体灌注（ILI）过程耐受性良好，灌注过程中未出现任何急性毒性，未出现中断即顺利完成整个灌注过程，但都有出现ILI相关的不良事件。患者1的腹股沟部位出现瘀伤，在第14天检查时仍未消退，至第30天检查时痊愈。患者2在基因转移当天可见股骨插管部位出血，并发生一次呕吐，至第60天检查时已痊愈。

转基因后，两名患者的淋巴细胞计数均出现短暂下降。患者2在基因转移后第1-14天内显示血红蛋白水平略低，推测与股骨部位出血相关，后未经治疗即恢复。患者1在第 60天时首次检查到轻微的库欣样脸部特征，及第90天时体重增加，为此将皮质类固醇剂量减少至基线水平；约在该例患者10.5岁，即接受转基因治疗后的第18个月时，检测到其心脏射学分数降低至54%，提示DMD疾病进展。患者2的心脏功能未出现此类变化。

• 血液、尿液样本分析

图1. 血清生化分析

如图1所示，接受转基因治疗后的两例患者未显示血清生化方面的不良信号。与典型的DMD患者一样，在基线检查时两例患者的血清转氨酶、血清肌酸激酶水平均升高。经转基因治疗后血清肌酸激酶水平得以降低，患者1降低幅度（15,653）大于患者2，但这更可能是因为该例患者DMD恶化后运动功能进一步衰退的结果。表征肝功能的血清γ-谷氨酰转移酶（GGT）水平未见升高，未见肝脏受累的信号。在血液学和凝血分析方面，包括血小板计数在内的指标未见异常。尿液分析未提示临床不良的重要信号，但在患者1两次尿样（第1天和第30天）中检测到红细胞，在患者2的两次尿样（第1天和第2天）中显示尿胆原水平为2mg/dL。

• 免疫应答

图2. 免疫应答（A）AAVrh74抗体滴定：ELISA法，>1:50为阳性；（B）酶联免疫斑点（ELISpot）法对病毒、基因相关蛋白肽的检测

经转基因治疗后，两例患者体内均检测到抗AAVrh74抗体（如图2），而治疗前未检测出rAAVrh74抗体（<1:12.5）；患者1在治疗后的第6个月时，抗体水平达到最高值；患者2的抗体水平更高，且多次达到最高值。采用ELISpot法检测T细胞应答，发现在多个时间点上T细胞对AAVrh74衣壳和GALGT2肽的阳性应答降低。如图2-B所示，在治疗后的第14天，两例患者均显现免疫应答峰值，随后第30天恢复；在患者2的第18个月时，可见外周血单核细胞（PBMC）出现几项应答小高峰，随后第24个月恢复。经评估认为，发生在两例患者的免疫应答升高不足以产生临床影响。

• 病毒载体在肌肉组织的分布

活组织检查显示，治疗前不能检测到病毒载体相关的DNA，治疗后的每次检测都可见其存在，说明AAV分布、转移至肌肉组织。与患者2相比，患者1接受的ILI剂量小一个数量级，至第3、4个月的活组织检查中，可见病毒载体在患者1中的转导明显低于患者2。

• GALGT2基因在体内的表达

经基线检测确认，两例患者的GALGT2基因表达与对照的健康者一致，但经转基因治疗后，每次检测都显示相比对照者更高的基因表达水平，尤以治疗后的第3、4个月开放式活检样本中最高。与对照健康者或基线水平相比，患者1的基因表达水平整体升高约6-8倍，患者2则升高了25-30倍。

• 免疫染色法与免疫印迹法检测

图3. WFA染色法评估转基因治疗对CT细胞的影响

细胞毒性T（CT）细胞若受到GALGT2基因影响，其中的聚糖链即可被紫藤凝集素（WFA）染色上，从而识别为阳性，而染色的量或说程度，可代表基因参与影响的程度。本研究观察到，两例患者在转基因治疗后的首次检测中，即显示比治疗前更高程度的染色率（图3）。对患者1，基线时的阳性率为1.59%，治疗后第4个月时为11.68%，升高了7.4倍；患者2则由基线时的0.49%，达到5.76%（第3个月），升高了11.69倍。

在第一个检测时间点，两例患者的活检样本中均观察到n乙酰半乳糖胺（GalNAc）阳性信号的分布存在相当大的不均匀性，从而在一份活检样本中区分出高染色区、低染色区，这可能反映了微血管供应的差异。另外，至第6个月、12个月检测时，染色程度相比转基因治疗初始降低，这与AAV在肌肉组织分布、GALGT2基因表达随治疗时间延长的变化基本一致。

因为GALGT2仅表达于神经-肌肉接头，难以按通常的方法进行免疫印迹，故需先对GALGT2蛋白进行浓缩，仅患者1收集到足够样本完成这项评估。无论是相比基线时，还是相比健康对照者，患者1治疗后在各个时间点的GALGT2蛋白评测中，均显示升高。GALGT2蛋白可以表达为长型（62 kDa），这是蛋白质的标准形式，也可以表达为短型（56 kDa），这是GALGT2转基因表达的形式。本次治疗显示患者1中这两种形式的蛋白都提高；以整体合计，治疗后第4个月检测时，GALGT2蛋白水平升高3.2±0.9倍。

• 临床疗效

图4. 治疗前后的运动功能变化

对于患者1，接受治疗时的年龄为8.9岁，运动功能已严重降低，步行测试（6MWT）为357m，步行100m需103.6s，相当于同龄人运动能力的28%；尽管接受转基因治疗，一年后仍失去了独立运动能力，此时年龄为10.4-10.9岁，但用力肺活量（FVC%）未降低，反而由基线时的85%升高至93%。研究者认为，转导后的病毒载体除了在10分钟内先分配至腿部肌肉，后续释放至全身，并可以刺激非靶向肌肉的表达，包括膈肌和心脏。

对于患者2，接受治疗时年龄为6.9岁，治疗后6MWT由405m增加到478m，但100m步行测试（100MWT）从67.5% 降至57.8%；治疗一年后的NSAA测试显示，由基线时的20升高至23，且评估显示治疗对躺、坐和跳方面的运动提升。基线时的FVC%为85%，治疗一年后为81%，下降甚微。值得注意的是，他的父母报告说，接受治疗后患者玩耍和上学时活动量增加，疲劳程度降低。

图5. 治疗前后的MVICT测试

最大自主等长收缩(MVICT)测试显示，患者1与基线值相比无改善，仅左膝伸展一项保持稳定；患者2在18个月内膝伸肌和屈肌力量（平均双腿）的产生能力有所改善（分别为+24%和+31%），在24个月的检查中右腿持续改善。

本篇作为仅包括2例DMD患者的首次人体临床试验属于一种探索性研究，其中显示出若干积极信息：

• 隔离肢体灌注（ILI）作为AAV microDys疗法的给药方法安全、耐受性良好，无显著的肝脏等器官毒性；尽管两例患者接受的总剂量都很大，但都没有出现血液学异常，如血小板减少，也没有对转基因编码或病毒抗原产生持续可检测的T细胞反应；

• 治疗对患者2的运动功能的持续提升非常吸引人，相比患者1的情况，说明该疗法倾向适用以高剂量治疗年龄更小的DMD患者，先前有关microDys疗法的人体研究也认为所选患者<7岁为佳；尤其是患者2的父母也反映患儿在日常生活和运动中运动能力稳定而持续的提升；

• AAV microDys基因治疗应用于临床尚需时日，如何改进腺相关病毒衣壳蛋白、使蛋白功能最大化、减少各种免疫反应仍是未来的主要研究方向，现有的临床试验结果均提示该创新疗法是Duchenne型肌营养不良症患者最有希望的治疗方法。

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[1]郑卉、张成. Duchenne 型肌营养不良症腺相关病毒介导的微小抗肌萎缩蛋白基因治疗研究进展. 中国现代神经疾病杂志,2019,19(05):320-328.

[2] Flanigan KM, et al. A first-in-human phase I/IIa gene transfer clinical trial for Duchenne muscular dystrophy using rAAVrh74.MCK.GALGT2. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 Sep 2;27:47-60.